蛋清溶菌酶的提取及其酶学性质探究（二）

2.1.3 NaCl溶液（洗脱液）浓度优化

由图3可知，蛋清随NaCl浓度的溶菌升高，溶菌酶的酶的酶学比活力先上升后下降，当NaCl浓度为1moL/L时，提取探究所得溶菌酶的性质比活力最高，此时的蛋清洗脱液浓度适宜提取分离溶菌酶。当NaCl浓度高于1moL/L时，溶菌酶的酶的酶学比活力反而下降，酶含量变化却不大，提取探究可能由于溶菌酶在高浓度盐溶液中发生盐析作用导致。性质

2.1.4 洗脱时间优化

由图4可知，蛋清当洗脱时间为60min时，溶菌所得溶菌酶的酶的酶学比活力最高，随着洗脱时间继续延长，提取探究酶含量增加缓慢，性质酶比活力反而下降，综合考虑经济成本，选定洗脱时间为60min。

2.2 阳离子交换法条件优化

综上，由单因素试验结果可知，阳离子交换法最优工艺条件为：蛋清滤液树脂比为10∶2.5，pH9.0，NaCl（洗脱液）浓度1mol/L，洗脱时间60min。由此，进一步做Box-Behnken试验优化阳离子交换法条件，试验设计及结果如表2所示。

采用DesignExpert8.0.6软件进行分析，如表3所示。由表3可知，拟合模型的P=0.0014＜0.05，说明模型与实际情况拟合良好。根据以上分析得知溶菌酶比活力R1对自变量每100mL蛋清滤液中树脂用量（A）、NaCl浓度（B）、蛋清滤液pH值（C）、洗脱时间（D）的多元回归方程为：

R₁=20866.66-1432.26A+194.18B+486.75C+539.58D-961.62AB-1252.19AC-2929.88AD-21.46BC-2724.86BD+90.11CD-6079.24A²-5995.65B²-3410.58C²-3903.162。

由方程可知，溶菌酶比活力和4个自变量之间具有显著线性关系。回归方程的二次项系数比较大，交互项系数中AD、BD的交互系数很大，说明树脂用量和洗脱时间、NaCl浓度和洗脱时间之间的交互效应很大，AB、AC的交互系数较大，说明树脂用量和NaCl浓度之间、树脂用量和pH值之间交互效应较大，而BC、CD的交互系数比较小，说明NaCl浓度和pH值之间、pH值和洗脱时间之间的交互效应小。

为了检验方程的有效性，对测定的溶菌酶的比活力的数学模型进行方差分析，并对各因子的偏回归系数进行检测。一次项中A的回归系数较显著，P=0.0806，说明蛋清树脂比对提取的溶菌酶比活力有较显著作用。二次项中A、B、C、D的偏回归系数均达到极显著水平。交互项AD、BD回归系数较其它因素显著，说明树脂用量和洗脱时间、NaCl浓度和洗脱时间之间的交互项对溶菌酶比活力影响较为显著。

为了得到最高的溶菌酶比活力，吸附和洗脱的各条件需要合适的交叉选择。响应面图可直观反映各因素及交互作用对酶活力的影响，故取3项显著性较高的交互项制作响应面图，根据图5～7的Box-Behnken优化试验拟合响应曲面图和方差分析得知，对溶菌酶比活力影响大小顺序为AD＞BD＞AC。

对二次回归方程求一阶偏导，当响应值R₁（溶菌酶比活力）为最大值时，各因子水平为每100mL蛋清滤液中，树脂用量（A）为24.20mL、NaCl浓度（B）为1.00mol/L、蛋清滤液pH值（C）为9.10、洗脱时间（D）为62.61min。此时理论预测溶菌酶比活力为21041.1U/mg。

对所获得的阳离子交换法各最优条件做平行验证试验，重复5次，如表4所示，得到的溶菌酶比活力为20509.58U/mg，与理论值接近。

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